Клеточные культуры

Бессмертные и стволовые клетки

Установленная или иммортализованная клеточная линия приобрела способность размножаться бесконечно либо через случайную мутацию, либо преднамеренную модификацию, такую ​​как искусственная экспрессия гена теломеразы. Многочисленные клеточные линии хорошо известны как типичные типы клеток.

Клеточные культуры

Массовая культура линий клеток животных имеет основополагающее значение для производства вирусных вакцин и других продуктов биотехнологии. Культура стволовых клеток человека используется для расширения их числа и дифференциации клеток на различные типы, пригодные для трансплантации. Культивирование клеток человека (стволовых) также используется для сбора молекул и экзосом, высвобождаемых стволовыми клетками для целей терапевтического использования.

История

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор, содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус, работая с культурой клеток саркомы цыплёнка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов (Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведённых с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa.

Применение

Буквальное значение культуры тканей относится к культивированию кусочков ткани, то есть к эксплантационной культуре.

Тканевая культура является важным инструментом для изучения биологии клеток из многоклеточных организмов. Она обеспечивает in vitro модель ткани в четко определенной среде, которой можно легко манипулировать и анализировать ее.

В культуре тканей животных клетки можно выращивать в виде двумерных монослоев (обычная культура) или внутри волокнистых лесов или гелей для достижения более натуралистических трехмерных тканеподобных структур (3D-культура). Эрик Саймон в докладе гранта NIH SBIR 1988 года показал, что электроспиннинг можно использовать для получения полимерных волокнистых каркасов нано- и субмикронного масштаба, специально предназначенных для использования в качестве клеточных и тканевых субстратов in vitro.

Это раннее использование электропроводных волокнистых решеток для клеточной культуры и тканевой инженерии показало, что различные типы клеток будут прилипать и размножаться на поликарбонатных волокнах. Было отмечено, что, в отличие от сплюснутой морфологии, обычно наблюдаемой в 2D-культуре, клетки, выращенные на электрошнурных волокнах, демонстрируют более округлую 3-мерную морфологию, обычно наблюдаемую в тканях in vivo.

Клеточные культуры

Культура растительной ткани, в частности, связана с выращиванием целых растений из мелких кусочков растительных волокон, культивируемых в среде.

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов , как коллагеназа , трипсин , проназа , разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации , но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы .

Культивирование клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах , при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур . Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, , концентрации глюкозы , составу факторов роста и др . Факторы роста , используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови . Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста .

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

  • Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
  • Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
  • Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл , рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
  • По той же причине может начаться клеточное дифференцирование .

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами , или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удалённых с их согласия .

Прорыв в середине века

Изначально получение и культивирование клеток практиковалось для того, чтобы найти панацею от множества опасных вирусов. Рядом исследователей было открыто, что многие штаммы вирусов могут спокойно жить, процветать и размножаться на искусственно выращиваемых клетках животных или даже целых органах, которые удерживаются автономно в специальных колбах. Как правило, для подобных испытаний используются клетки органов животных, максимально приближенных к человеку — к примеру, высших приматов вроде шимпанзе. Все эти открытия были совершены в 1940-х годах, когда эксперименты над людьми в силу определенных причин были наиболее актуальны.

Типы исследуемого материала

Клеточные культуры

Различают 2 основных вида культур тканей растений:

  • Получаемые без разрушения и сохраняющие характерные особенности, присущие живому организму.
  • Извлекаемые в результате расщепления (химического, ферментативного или механического) из первичной ткани. Могут формироваться из одной или нескольких клеточных культур.

По способу выращивания выделяют следующие методы:

  • на «кормящем слое», при котором вещество, стимулирующее рост тканей, выделяют делящиеся клетки того же вида растений;
  • с использованием ткани-«няньки», которая находится рядом с культивируемыми клетками;
  • применение питательной среды от обособленной делящейся клеточной группы;
  • выращивание отдельных единичных клеток в микрокапле, насыщенной по составу.

Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.

Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.

Применение

Клеточные культуры

Метод культуры тканей используется для проведения исследований:

  • процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
  • межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
  • взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
  • результатов генетических манипуляций с клетками.

Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:

  • получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
  • направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
  • клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
  • выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
  • криоконсервация генофонда;
  • реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).

Вводная информация

Клеточные культуры

Так что же собой представляют клеточные культуры? Как известно, организм не является чем-то целостным. Он формируется из различных клеток, каждая из которых выполняет определенную функцию. Если отделить их грубым методом, то они быстро погибнут. Но клетки можно аккуратно извлекать и создавать им такие условия, в которых они смогут продолжать свою деятельность и размножаться. Вот так и формируются клеточные культуры.

Как же их получают? Как ни странно, но в качестве основы используются такие клетки, которые потеряли способность к делению в составе организма. Например, лейкоциты периферической крови. Использование культивирования позволяет решать ряд теоретических проблем. Кроме этого, благодаря нему был дан ответ на целый ряд прикладных задач.

Общие клеточные линии

Линии клетки человека

60 линий раковых клеток национального Онкологического института (NCI60)

  • DU145 (рак простаты)
  • Lncap (рак простаты)
  • MDA-MB-438 (рак молочной железы)
  • PC3 (рак простаты)
  • T47D (рак молочной железы)
  • THP-1 (острая миелоидная лейкемия)
  • U87 (глиобластома)
  • Клетки нейробластомы Человека SHSY5Y, клонированные от миеломы
  • Клетки Saos-2 (рак костей)
  • Клетки KBM-7 (хроническая миелогенная лейкемия)

Клеточные линии примата

Vero (африканская зеленая обезьяна линия эпителиальной клетки почки Chlorocebus, начатая в 1962)

Опухолевые клеточные линии крысы

  • GH3 (гипофизарная опухоль)
  • PC12 (феохромоцитома)

Клеточные линии мыши

MC3T3 (эмбриональный calvarium)

Линии растительной клетки

Табак — 2 клетки (сохраненный как культура приостановки клетки, они — образцовая система растительной клетки)

Другие клеточные линии разновидностей

  • Данио-рерио ZF4 и клетки AB9
  • Линия эпителиальной клетки почки собаки Madin-правила-штукатура (MDCK)
  • Эпителиальные клетки почки Xenopus A6

Культура неклеток млекопитающих

Методы культуры растительной клетки

Культуры растительной клетки, как правило, выращиваются как культуры приостановки клетки в жидкой среде или как культуры костной мозоли на твердой среде. Культивирование недифференцированных растительных клеток и виолончелей требует надлежащего баланса ауксина соматотропинов завода и cytokinin.

Клеточная культура насекомого

Клетки, полученные из Дрозофилы melanogaster (наиболее заметно, Шнайдер 2 клетки), могут использоваться для экспериментов, которые может быть трудно сделать на живых мухах или личинках, таких как биохимические исследования или исследования, используя siRNA. Клеточные линии, полученные из армейского червя Spodoptera frugiperda, включая Sf9 и Sf21, и от выполняющего мертвую петлю летчика капусты Трикоплусии ni, клеток Хлопка по ладони, обычно используются для выражения рекомбинантных белков, используя baculovirus.

Бактериальный и методы культуры дрожжей

Для бактерий и дрожжей, небольшие количества клеток обычно выращиваются на основательной поддержке, которая содержит питательные вещества, включенные в него, обычно гель, такие как агар, в то время как крупномасштабные культуры выращены с клетками, приостановленными в питательном бульоне.

Вирусные методы культуры

Культура вирусов требует культуры клеток млекопитающих, завода, грибковое или бактериальное происхождение как хозяева к росту и повторению вируса. Целые дикие вирусы типа, рекомбинантные вирусы или вирусные продукты могут быть произведены в типах клетки кроме их естественных хозяев при правильных условиях. В зависимости от видов вируса инфекция и вирусное повторение могут привести к клетке — хозяину lysis и формированию вирусной мемориальной доски.

Необходимые условия

Клеточные культуры

Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:

  • Соблюдение стерильности. Для проведения пересадок применяются специальные боксы с подачей очищенного воздуха, оснащенные ультрафиолетовыми лампами. Асептической обработке должны подвергаться инструменты и материалы, одежда и руки персонала.
  • Использование специально подобранных питательных сред, содержащих источники углерода и энергии (обычно сахароза и глюкоза), микро- и макроэлементы, регуляторы роста (ауксины, цитокинины), витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислота и другие).
  • Соблюдение температурного (18-30° С), светового режима и влажности (60-70 %). Большинство каллусных культур тканей выращивают при рассеянном свете, так как они не содержат хлоропластов, но для некоторых растений требуется подсветка.

В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).

История

Английский физиолог 19-го века Сидни Рингер развил рассолы, содержащие хлориды натрия, калия, кальция и магния, подходящего для поддержания избиения изолированного сердца животных за пределами тела. В 1885 Вильгельм Рукс удалил часть медуллярной тарелки с эмбриональным цыпленком и поддержал его в теплом соляном растворе в течение нескольких дней, установив принцип культуры клеток тканей. Росс Грэнвиль Харрисон, работающий в Медицинской школе Джонса Хопкинса и затем в Йельском университете, издал результаты своих экспериментов с 1907 до 1910, установив методологию культуры клеток тканей.

Методы клеточной культуры были продвинуты значительно в 1940-х и 1950-х чтобы поддержать исследование в вирусологии. Рост вирусов в клеточных культурах позволил подготовку очищенных вирусов для изготовления вакцин. Вводимая вакцина против полиомиелита, развитая Джонасом Солком, была одним из выпускаемых серийно методов клеточной культуры использования первых продуктов. Эта вакцина была сделана возможной исследованием клеточной культуры Джона Франклина Эндерса, Томаса Хакла Уэллера и Фредерика Чепмена Роббинса, кому присудили Нобелевский приз за их открытие метода роста вируса в клеточных культурах почки обезьяны.

Ограничения

Клеточные культуры

Почему же рано или поздно клеточные культуры гибнут? Это связано с так называемым пределом Хейфлика. Считается, что старение клеток является результатом заложенных механизмов. Что интересно, так это то, что раковые опухоли в этом плане ведут себя немного иначе. Например, они не подчиняются пределу Хейфлика. Кроме этого, когда на поверхности исследовательских сосудов не остается места, они все равно продолжают размножаться. Таким образом, опухолевая клеточная культура становится многослойной. Самый старый ее лабораторный представитель уже «живет» добрые полвека.

Следует отметить, что очень часто наблюдается дифференцирование. Например, могут синтезироваться специфические белки или сохраняются морфологические особенности. Культивирование клеток иногда может привести к появлению новых свойств, но нередки случаи, когда они же пропадают

Это также очень важно при изучении механизмов деятельности. Кстати, эти свойства привели к тому, что некоторые клеточные культуры создаются с практической целью – получение синтезируемых веществ

Именно таким образом и достают антитела к различным белкам.

От прошлого к будущему

Готлиб Хаберландт впервые указал на возможность культивирования изолированных тканей растений. Он предположил, что этим методом можно определить возможности отдельных клеток через тканевую культуру, а также взаимное влияние тканей друг на друга. Поскольку оригинальные утверждения Хаберланда были реализованы, методы тканевой и клеточной культуры стали активно применяться, что привело к новым открытиям в биологии и медицине. Его первоначальная идея, представленная в 1902 году, называлась тотипотенциальностью: «Теоретически все растительные клетки способны породить полное растение». Культивирование культур клеток в то время продвинулось резко вперед.

В современном использовании тканевая культура обычно относится к росту клеток из ткани многоклеточного организма in vitro. Условия культивирования клеток при этом не очень важны. Эти клетки могут быть выделенными из донорского организма, первичными клетками или иммортализованной клеточной линией. Клетки омывают культуральной средой, которая содержит питательные вещества и источники энергии, необходимые для их выживания. Термин «тканевая культура» часто используется взаимозаменяемо с клеточной культурой.

Клеточные культуры

Извлеченным из организма клеткам можно создать такие условия, при которых
они будут жить и размножаться в искусственной среде (in vitro — вне
организма, в отличие от in vivo — в организме), образуя культуру клеток.
Клеточные культуры можно получать из таких клеток, которые в составе
организма потеряли способность к делению, например из лейкоцитов
периферической крови. Изучение поведения клеток в культуре помогает понять
механизмы контроля деления клеток. Установлено, что в этом контроле главную
роль играют клеточные взаимодействия. Наблюдение за клеточными культурами
показало, что клетки активно делятся и расползаются по стеклу сосуда, в
котором их культивируют до тех пор, пока они не начнут соприкасаться друг с
другом. Контакт поверхностей соседних клеток приводит к остановке их
движения и одновременно выключает клетки из размножения. Когда клетки
плотным слоем покроют всю доступную им поверхность сосуда, деления
прекратятся. Некоторое время клетки будут жить, потом в них начнут
возникать всевозможные нарушения, и если часть клеток не пересадить в
другой сосуд, на новую среду, то культура погибнет. Интересно, что пересев
клеток на новую среду не всегда стимулирует клеточное размножение. Клетки,
претерпевшие несколько пересевов, со временем не приступают к делению даже
на новой среде. Специальные эксперименты показали, что клетки, взятые из
тканей взрослых организмов, способны делиться in vitro меньшее число раз,
чем клетки, полученные из эмбрионов. Причину этого явления, названного по
имени открывшего его ученого
феноменом Хейфлика
, многие исследователи видят в старении клеток, и в настоящее время
клеточные культуры служат объектом изучения механизмов старения на
клеточном уровне. Клетки, взятые из раковых опухолей, ведут себя в культуре
немного иначе. Контакт поверхностей клеток не останавливает их делений, они
продолжают размножаться и культура становится многослойной. Не подчиняются
опухолевые клетки и правилу Хейфлика: они могут претерпевать неограниченное
число делений. Некоторые клетки в культуре остаются дифференцированными:
синтезируют специфические белки, сохраняют морфологические особенности,
например опухолевые клетки лимфоидного происхождения. Другие клетки при
переносе их в искусственные условия становятся недифференцированными.
Изменение условий выращивания иногда приводит к потере, иногда к
приобретению свойств дифференцированных клеток. Это позволяет использовать
клетки в культуре для изучения механизмов клеточной дифференцировки.
Сохранение некоторыми клетками in vitro дифференцированного состояния
послужило толчком для создания клеточных культур с практическими целями для
получения из них веществ, которые синтезируются этими клетками. Так
получают антитела к различным белкам. Можно получать и лекарственные
вещества из клеток тех растений, которые плохо выращиваются на плантациях.
Клеточные культуры нашли применение и в медицине. Для диагностики
наследственных заболеваний иногда необходимо достаточно большое количество
клеток организма для того, чтобы можно было провести биохимический анализ.
Если диагноз нужно установить у эмбриона человека, то взятие материала на
анализ представляет большую проблему. В этом случае на помощь приходит
техника клеточных культур: несколько сотен клеток, взятых из ворсинок
оболочки зародыша без вреда для него, достаточно, чтобы вырастить большую
клеточную массу. Клеточные культуры используют и в вирусологии — для
выращивания вирусов и изучения их свойств, а также в фармацевтической и
химической промышленностях для исследования повреждающего действия на ДНК и
хромосомы вновь синтезированных химических веществ.

Михаил Фирсов
Оцените автора
( Пока оценок нет )
Добавить комментарий